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| 正交试验优选熟地黄提取工艺 |
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| 作者：科室 文章来源：本站原创 点击数： 更新时间：2006-12-8 |
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熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa.Libosch的块茎，经加工炮制而成。性味甘，微温。归肝、肾经。具有补血滋阴，益精填髓之功效。现代药理研究发现熟地黄具有调节免疫功能，影响心血管系统、造血系统、内分泌系统，中枢神经系统等各方面活性，并具有抗肿瘤、抗衰老及降血糖等多方面功效[1，2]。
熟地黄经炮制后，所含成分发生较大变化，梓醇、多糖等成分较生地黄显著减少，而5-羟甲基糠醛、寡糖及低聚糖等成分含量明显增高。现代药理表明，熟地黄经炮制后的成分改变与其炮制后补血滋阴功效增强相吻合。目前，未见熟地黄提取工艺研究的报道。因此现采用正交实验法，以其补血的主要成分糖类、5-羟甲基糠醛的含量为评价指标，对熟地黄的提取工艺进行优化选择，为合理开发利用熟地黄提供科学依据。 1．材料
Agilent1100高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1315A二极管阵列检测器（美国惠普公司）； Lambda 25 UV/VIS spectrometer（美国 PerkinElmer 公司）；AG285分析天平（德国梅特勒公司）；KS-600D超声清洗机（宁波科生仪器厂）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）。5-羟甲基糠醛对照品（批号：111626-200402）、D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-200302）均购自中国药品生物制品检定所，乙腈色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1 HPLC法测定5-羟甲基糠醛含量
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18（250×4.6 mm，5μm）；柱温：35℃；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；流动相：水-乙腈（85：15）；进样量：10 μL。理论塔板数按5-羟甲基糠醛计算应不低于3000，在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱图见图1。
t/min t/min
A B
图1 HPLC色谱图 A.对照品；B.熟地黄；1. 5-羟甲基糠醛
2.1.2 对照品溶液制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品8.10 mg置100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.1.3 线性关系的考察
精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 mL分别置100 mL容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，5-羟甲基糠醛溶液的量为横坐标作图，得线性回归方程：y= 7.072 5x - 6.993 3 ，r=0.999 9。表明5-羟甲基糠醛溶液在16.2～97.2 ng间线性关系良好。
2.1.4 供试品溶液的制备及测定
精密量取熟地黄提取液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇15 mL，超声15 min，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在上述色谱条件下取10μL进样测定，计算。
2.2熟地黄总糖含量测定
2.2.1 对照品溶液制备
精密称取葡萄糖对照品100.9 mg，置100 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成浓度为1.009 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液。
2.2.2 标准曲线的制备
精密吸取1、2、3、4、5、6 mL，分别置50 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。分别精密吸取以上溶液各2 mL，置具塞试管中，加5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL，摇匀，水浴15 min，立即冷却。10 min后，用分光光度法在490 nm处测定吸收度（另用蒸馏水随行做空白对照）。得回归方程：C=66.50A-0.06，r=0.999 7。
2.2.3 供试品溶液的制备及测定
精密吸取熟地黄提取液5 mL，置500 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2mL，置具塞试管中，照标准曲线制备方法，于490 nm处测定吸光度度值，计算总糖含量。
2.3 正交试验设计
选择浸泡时间、提取时间、加水量三个因素，每个因素选择三个水平，每个因素设3个水平，因素水平见表1，试验设计结果见表2，方差分析见表3。
称取熟地黄药材30 g，按表2 的设计进行回流提取，趁热滤过，合并二次提取液，浓缩并定容至500 mL，按2.1、2.2 项下方法测定提取液中5-羟甲基糠醛、熟地黄总糖含量，计算。
表1 因素水平表
|
水 平
|
A
浸泡时间/h
|
B
提取时间/min
|
C
加水量/倍
|
|
1
2
3
|
0
2
4
|
60，45
90，60
120，90
|
12，10
10，8
8，6
|
表2 正交实验设计及结果
|
试验号
|
A
|
B
|
C
|
D
|
5-羟甲基糠醛
含量/mg
|
总糖含量
/%
|
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
10.77
|
43.82
|
|
2
|
1
|
2
|
2
|
2
|
8.57
|
46.67
|
|
3
|
1
|
3
|
3
|
3
|
9.49
|
45.30
|
|
4
|
2
|
1
|
2
|
3
|
7.3
|
41.36
|
|
5
|
2
|
2
|
3
|
1
|
8.35
|
45.38
|
|
6
|
2
|
3
|
1
|
2
|
11.88
|
46.54
|
|
7
|
3
|
1
|
3
|
2
|
7.48
|
43.88
|
|
8
|
3
|
2
|
1
|
3
|
12.57
|
49.74
|
|
9
|
3
|
3
|
2
|
1
|
10.64
|
50.71
|
|
Ⅰ1
|
28.83
|
25.55
|
35.22
|
29.76
|
|
|
Ⅱ1
|
27.53
|
29.49
|
26.51
|
27.93
|
|
|
Ⅲ1
|
30.69
|
32.01
|
25.32
|
29.36
|
|
|
R1
|
3.16
|
6.46
|
9.9
|
1.83
|
|
|
Ⅰ2
|
133.79
|
127.06
|
138.10
|
137.91
|
|
|
Ⅱ2
|
133.28
|
141.79
|
138.74
|
137.09
|
|
|
Ⅲ2
|
144.33
|
142.55
|
134.56
|
136.40
|
|
|
R2
|
11.05
|
11.49
|
3.54
|
1.51
|
|
表3 方差分析表
|
|
方差来源
|
离差平方和
|
自由度
|
均方
|
F值
|
P值
|
|
5-羟甲基糠醛
|
A
|
1.68
|
2
|
0.85
|
2.74
|
|
|
B
|
7.07
|
2
|
3.54
|
11.42
|
|
|
C
|
19.48
|
2
|
9.74
|
31.42
|
＜0.05
|
|
D（误差）
|
0.62
|
2
|
0.31
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
熟地黄总糖
|
A
|
25.94
|
2
|
12.97
|
64.85
|
＜0.05
|
|
B
|
50.83
|
2
|
25.42
|
127.10
|
＜0.01
|
|
C
|
3.38
|
2
|
1.69
|
8.45
|
|
|
D（误差）
|
0.39
|
2
|
0.20
|
|
| F0.05(2,2)=19.00 F0.01(2,2)=99.00
2.4正交实验结果分析
以熟地总糖含量为考察指标的正交试验直观分析及方差分析的结果表明，因素B对试验结果影响最大，以后依次为A、C。因素B对试验结果具有极显著意义，B3提取效果最好，宜选择B3；因素A对试验结果具有极显著意义，A3提取效果最好，宜选择A3；因素C对熟地总糖含量无显著性影响，故可选择任一水平。
以5-羟甲基糠醛含量为考察指标的正交试验直观分析及方差分析的结果表明，因素C对试验结果影响最大，以后依次为B、A。因素C对试验结果具有显著意义，C1提取效果最好，宜选择C1；因素A、B对5-羟甲基糠醛含量无显著性影响，故可选择任一水平。综上所述，故确定熟地黄最佳水提工艺条件为A3B3C1。即浸泡时间4 h，提取提取2次，第一次加12倍量的水，提取120 min；第二次加10倍量水，提取90 min。
2.5 验证试验
称取药材按A3B3C1进行验证试验，结果与正交试验结果吻合，说明工艺可行。
3 讨论
熟地黄经过炮制糖类成分发生较大变化，多糖显著减少，而寡糖及低聚糖明显增加，现代医学认为地黄炮制前后成分变化与熟地黄益精补血关系密切，还原糖类的甘露三糖、蜜二糖及葡萄糖、果糖等具有补气血作用[3，4]。并且笔者对熟地黄及熟地黄提取液分别进行了总多糖及总糖的含量测定，结果表明，熟地黄及其提取液中总多糖含量仅仅为总糖含量的3%左右，表明熟地黄中主要含寡糖及低聚糖，与文献报道相吻合。故本文用“熟地总糖”作为评价指标，而非“熟地多糖”。
另外，文献报道地黄炮制过程中5-羟甲基糠醛的含量显著增加[5]，药理实验表明5-羟甲基糠醛具有明显的抗氧化和心血管系统作用[6]。因此选择熟地黄总糖及5-羟甲基糠醛的含量作为提取工艺的评价指标。并且，为合理选择正交设计各水平，对提取次数进行了考察，发现提取2次，地黄总糖及5-羟甲基糠醛的相对转移率均可达85%，故在正交试验中，设计提取次数为2次。 |
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